УДК 535.15:535.243. Колебательная спектроскопия альбумина и коллагена при взаимодействии с лазерным излучением. Ю.О.Федорова. Национальный исследовательский университет «МИЭТ», г. Москва


УДК 535.15:535.243
Колебательная спектроскопия альбумина и коллагена при взаимодействии с лазерным излучением
Ю.О.Федорова
Национальный исследовательский университет «МИЭТ», г. Москва, Россия,
e-mail: [email protected]
Vibrational spectroscopy of albumin and collagen upon the interaction with the laser radiation
Yu.O. FedorovaNational Research University of Electronic Technology, Moscow, Russia,
e-mail: [email protected]
Одним из способов исследования воздействия лазерного излучения на белки является анализ их колебательных спектров поглощения или рассеяния света. Для исследования физико-химических свойств были выбраны белки: бычий сывороточный альбумин (БСА) и коллаген, как наиболее распространенные в организме и отличающиеся хорошей биосовместимостью. Из проведенного анализа частот и интенсивностей соответствующих полос поглощения и линий КР колебаний амидной группы, которые широко используются для установления пространственной структуры полипептидной цепи, сделан вывод о произошедших изменениях во внутренней структуре белков.
Ключевые слова: коллаген, бычий сывороточный альбумин, лазерное излучение, колебательная спектроскопия, денатурация
One way to study the effect of laser radiation on proteins is to analyze their vibrational absorption or scattering spectra. To study the physico-chemical properties of proteins, bovine serum albumin (BSA) and collagen were selected as the most common in the body and characterized by good biocompatibility. From the analysis of the frequencies and intensities of the corresponding absorption bands and Raman lines of the amide group oscillations, which are widely used to establish the spatial structure of the polypeptide chain, it is concluded how the internal structure of the proteins has changed.
Key words: collagen, bovine serum albumin, laser radiation, vibrational spectroscopy, denaturationСреди органических веществ белки являются самыми многочисленными, наиболее разнообразными по своему составу и важнейшими биополимерами в организме человека. Белки представляют собой высокомолекулярные органические вещества, которые состоят из аминокислот, соединённых в цепочку пептидной связью. За счет различных комбинаций из 20 часто встречающихся аминокислот создается бесконечное разнообразие белков в организме человека.
Последовательность аминокислот, соединенных пептидными связями, называется первичной структурой белка. Пространственное расположение такой цепочки, закрученной в виде спирали или складчатого слоя, называется вторичной структурой. Полипептидная цепь удерживается в таком положении за счет системы водородных связей и дисульфидных мостиков, повреждение которых ведет к нарушению нормального функционирования молекулы белка. Удерживание вторичной структуры водородными связями в пространстве называется третичной структурой. Четвертичная структура белка формируется как комбинация двух или более полипептидных цепей, каждая из которых имеет свою первичную, вторичную и третичную структуры. Таким образом, зная внутреннюю структуру белка можно судить о наличии тех или иных внутренних связей, которые удерживают его в строго определенном положении. Если знать, какие связи повреждены, то можно будет судить в целом о степени повреждения внутренней структуры белка [1,2].
Колебательная спектроскопия – метод исследования строения вещества по спектрам поглощения или рассеяния света, связанным с переходами между энергетическими состояниями, которые характеризуются различными колебаниями атомов относительно равновесных положений [3].
Колебательные спектры вещества можно получить или в результате поглощения веществом инфракрасного излучения (ИК спектроскопия), или при рассеянии монохроматического видимого и ультрафиолетового излучения (спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) – рамановская спектроскопия)
Спектры колебаний, полученные с помощью инфракрасной и рамановской спектроскопии, дополняют друг друга, что позволяет более точно установить наличие или отсутствие определенных функциональных групп в молекуле белка. За счет создания баз ИК и КР спектров некоторых классов соединений, стало возможным автоматически сравнивать вещества с ранее известными, а также выявлять произошедшие структурные изменения в молекулах белков.
Материалы и методы
В данном исследовании были получены ИК и рамановские спектры для 2 групп образцов белков: БСА и коллагена. Выбор данных белков обусловлен их хорошей биосовместимостью и относительно недорогой стоимостью.
БСА был произведен в фирме BioClot (Германия) и представляет собой кристаллы желтого цвета 98,1 мас. % чистоты. Массовая доля примесей тяжелых металлов в БСА не превышает 0,001 %.
Коллаген производства фирмы Белкозин-Про (Россия) представляет собой легкий волокнистый порошкообразный продукт серо-белого цвета с нейтральным запахом. Массовая доля белка составляет не менее 90 %, жира – не более 3 %. Массовая доля влаги – не более 10 %.
Для исследования использовались образцы исходных порошков и приготовленные водные растворы БСА и коллагена (рисунок 2). Процесс приготовления образцов БСА происходил следующим образом: предварительно взвешенный порошок добавлялся в воду в пропорциях 1:3 (БСА: вода). Далее состав перемешивался в течение 1 часа с использованием магнитной мешалки. После перемешивания небольшое количество жидкости (1-3 мл) помещалось в стеклянные цилиндры диаметром 2 см. Концентрация БСА составила 25%.
Процесс приготовления образцов коллагена происходил следующим образом: предварительно взвешенный порошок порционно добавлялся в воду и перемешивался в течение 1,5 часа с использованием магнитной мешалки. После перемешивания небольшое количество состава (1-3 мл) помещалось в стеклянный цилиндр диаметром 2 см. Концентрация коллагена составила 7%.
Водные растворы БСА и коллагена наносились точечно на предметное стекло и облучались лазерным излучением (длина волны лазерного излучения: 810 нм, мощность: 5 Вт) 1-2 минуты каждая капля. Экспериментальные образцы нагревались лазерным излучением в интервале температур от 60 до 90 °С с шагом в 10 °С.
Исследования проводились на ИК Фурье-спектрометре Nicolet iS50 и спектрометре LabRAM HR Evolution.
Результаты
Был проведен анализ частот и интенсивностей соответствующих полос поглощения и линий КР колебаний амидной группы: Амид I (1655–1675 см-1), Амид II (1560 см-1), Амид III (1240–1260 см-1), которые широко используются для установления пространственной структуры полипептидной цепи белков. Амиды являются функциональными производными карбоновых кислот, которые получаются посредством замещения атомов водорода в аминогруппе на остаток кислоты.
Для спектров образцов альбумина и коллагена характерно изменение амплитуды полос Амид I и Амид III относительно прочих полос спектров для образцов, подвергнутых воздействию лазерного излучения. Подобные спектральные изменения связаны с изменениями, происходящими во вторичной структуре исследуемых белков вследствие термического воздействия. Представлено на рисунке 3-6. При нагреве до 60 °С виден скачок интенсивности, что объясняется увеличением полярности связей в аминокислотах, вызванным возрастанием частоты колебаний с ростом температуры. В диапазоне температур от 70 до 90 °С наблюдается уменьшение интенсивности, которое можно объяснить разрывом связей внутри белков вследствие термического нагрева. При нагреве выше 80 °С следует повреждение внутренних связей в молекуле на уровне как третичной, так и вторичной структуры (характерное повреждение полос Амид I и Амид III), что свидетельствует о нарушении нормального функционирования белка. Следует отметить, что более резкое уменьшение интенсивности наблюдалось у БСА, а коллаген оказался более устойчив к повышению температуры.
Таким образом, белки оказались устойчивыми к повышению температуры до 80 °С, с незначительными повреждениями во вторичной структуре, что позволяет использовать их в качестве биоприпоя в лазерной хирургии.
Работа выполнена в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной Россиии" на 2009-2013 год по проекту П216 от 23.04.2010г.

аб
Рисунок 2 – Внешний вид порошков: а – БСА, б - коллаген

Рисунок 3 – ИК спектр, полученный при нагревании БСА
Рисунок 4 – КР спектр, полученный при нагревании БСА

Рисунок 5 – ИК спектр, полученный при нагревании коллагена

Рисунок 6 – КР спектр, полученный при нагревании коллагена
Список источников
1. Balakhnina I.A., Brandt N.N. Low – frequency vibrational spectroscopy of proteins with different secondary structures. //Journal of Biomedical Optics. – 2017. – Vol. 22, № 9. – P. 91 –96.
2. Benedicto de Campos Vidal, Maria Luiza S. Mello. Collagen type I amide I band infrared spectroscopy. //Micron 42. – 2011 – P. 283–289.
3. Wisniewski M., Sionkowska A., Kaczmarek H., Lasare S., Tokarev V., Belin C. Spectroscopic study of KrF excimer laser treated surface of the thin collagen films. //Journal of photochemistry and photobiology. – 2007. – Vol. 188, № 1. – P. 192-199.

Приложенные файлы

  • docx 15044962
    Размер файла: 353 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий