Интерлейкин-17А является гомодимером с молекулярной массой каждого полипептида 17500Да. IL-17А продуцируется в основном активированными Т-лимфоцитами.

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАКТИВОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ИНТЕРЛЕЙКИНА-17А ЧЕЛОВЕКА “ИФА-IL-17А”

1.НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реактивов “ИФА-IL-17А” предназначен для количественного определения биологически-активного димера интерлейкина-17А человека в исследуемых образцах методом твердофазного иммуноферментного анализа.
Интерлейкин-17А является гомодимером с молекулярной массой каждого полипептида 17500Да. IL-17А продуцируется в основном активированными Т-лимфоцитами. Играет ключевую роль при инфекционных и аутоиммунных заболеваниях. Усиливает действие провоспалительных цитокинов. Определение интерлейкина-17А имеет важное значение для исследования механизмов воспалительного процесса и иммунного ответа.

ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА

Состав набора:
комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов с рамкой с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к интерлейкину-17А, маркирован “Стрипы с моноклональными антителами”;
7 калибровочных проб, содержащих известные количества интерлейкина-17А - 0; 250; 500; 1000; 2500; 5000 и 10000пг\ мл, лиофилизованные препараты;
аналитический буферный раствор, маркирован “Буфер А”, 1 флакон;
концентрированный раствор коньюгата анти-IL-17А-пероксидаза, маркирован “Коньюгат Е”, 1 флакон;
концентрированный буферный раствор для промывок лунок, маркирован “Буфер Р”, 1 флакон;
субстратный буфер, маркирован “Буфер С”, 1 флакон;
10% кислота, маркирована “Стоп-реагент”, 1 флакон;
раствор тетраметилбензидина, маркирован “ ТМБ”;

2.2. Набор “ИФА-IL-17А” рассчитан на проведение анализа в дубликатах 41 неизвестных и 7 калибровочных проб при использовании всех стрипов одновременно.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости набор может быть разделен на 3 независимые части с различным количеством определяемых проб. В случае дробного применения набор должен быть использован в течение 2 недель после вскрытия компонентов набора.
2.3. Принцип работы набора. В наборе “ИФА-IL-17А” использован “сэндвич”-вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта моноклональное антитело к интерлейкину-17А иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок). На первой стадии анализа IL-17А, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах, связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный IL-17А взаимодействует с теми же антителами, коньюгированными с пероксидазой. Таким образом мы открываем только димер интерлейкина 17. Количество связавшегося коньюгата прямо пропорционально количеству IL-17А в исследуемом образце.
Во время инкубации с субстратной смесью происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченных антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация IL-17А в определяемых образцах.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ

Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.
При работе с набором следует соблюдать “Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР”, Москва, 1982г.

ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ

полуавтоматические одноканальные пипетки с изменямым объемом отбора жидкостей: от 0,005 до 0,02 мл; от 0,05 до 0,25 мл; от 0,2 до 1 мл; от 1 до 5 мл.
восьмиканальная полуавтоматическая пипетка, позволяющая отбирать объемы жидкости до 0,3 мл.
прибор для встряхивания рамки со стрипами (шейкер), позволяющий производить встряхивание с амплитудой колебания 3-4мм и частотой 4-17А Гц при комнатной температуре (+16-250С), либо термостатируемый шейкер, позволяющий производить встряхивание в том же режиме при температуре +370С;
спектрофотометр, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450 нм;
мерные цилиндры, позволяющие отмерять 10 и 100 мл;
2 стеклянных стакана емкостью 20 мл и один - 150 мл;
дистиллированная вода

ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

5.1. Калибровочные пробы. Во флаконы с калибровочными пробами добавить по 0,5 мл дистиллированной воды, выдержать в течение 20 мин. и затем тщательно перемешать до полного растворения, избегая пенообразования. Хранить при температуре +4...60 С в течение трех суток; при необходимости более длительного хранения разлить по 160 мкл ( чтобы избежать повторного замораживания) и хранить при температуре -200 С не более месяца.
Стрипы. Вскрыть и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы не вскрывать, хранить в герметично закрытом пакете из фольгированного полиэтилена при температуре +2...60C.
Промывочный буфер. В стакан с 480 мл дистиллированной воды добавить содержимое флакона с маркировкой «Буфер Р». Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Хранить промывочный буфер закрытым при температуре +2...80С
Буфер А готов к использованию. Хранить закрытым при температуре +2...60 С.
Коньюгат Е. антитело-пероксидаза. В зависимости от количества используемых стрипов подготовить необходимый объем однократного раствора коньюгата путем смешивания 40 мкл концентрированного Коньюгата Е с 1 мл промывочного буфера из расчета на один стрип. Однократный раствор Коньюгата Е должен быть использован в течение часа, длительному хранению не подлежит.
Субстратная смесь приготовляется непосредственно перед употреблением
“Стоп-реагент” готов к использованию.


ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

6.1. В зависимости от количества определяемых образцов подготовить соответствующее количество реагентов, которые перед проведением анализа должны быть тщательно перемешаны и доведены до комнатной температуры. В таблице 1 приведены расход реагентов в зависимости от количества используемых стрипов.
6.2. Внести во все лунки по 0,1 мл “Буфер А”
6.3. Внести в соответствующие лунки по 0,05 мл калибровочных проб или исследуемой сыворотки в дубликатах, внесение образцов не должно занимать более 15 мин.
6.4. Инкубировать стрипы при температуре 37оС в течение 2 часа со встряхиванием.
6.5. По окончании инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки три раза. При каждой промывке во все лунки добавить по 0,25 мл промывочного буфера, приготовленного по п.5.3, встряхнуть рамку на шейкере в течение 5-10 сек с последующим декантированием. При каждом декантировании тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

Таблица 1 Расход реагентов для проведения анализа





Субстратная смесь

Количество используемых стрипов, шт
Буфер А, мл
Коньюгат , мл
Буфер Р, мл
РастворТМБ, мл
Буфер С мл


2
2
2
50
0,4
2

3
3
3
75
0,6
3

4
4
4
100
0,8
4

5
5
5
125
1,0
5

6
6
6
150
1,2
6

7
7
7
175
1,4
7

6
6
6
200
1,6
8

9
9
9
225
1,8
9

10
10
10
250
2,0
10

11,12
12
12
300
2,0
10


6.6. Внести во все лунки по 0,1 мл раствора коньюгата Е, приготовленного по п.5.5.
6.7. Инкубировать стрипы при температуре 37оС в течение 1 часа со встряхиванием.
6.8. По окончании инкубации лунки промыть ( см. пункт 6.5)
6.9. Перед окраской стрипы желательно сполоснуть дистиллированной водой для более полного удаления не связавшего коньюгата.
6.10. За 5 минут до окончания инкубации приготовить необходимое количество субстратной смеси (см. Табл.1): в стакан, содержащем субстратный буфер из флакона с маркировкой “Буфер С”, внести необходимый объем раствора тетраметилбензидина из флакона с маркировкой “ ТМБ”. Тщательно перемешать и поставить в темное место до использования. ВНИМАНИЕ !!! Чисто вымытый стакан для приготовления субстратной смеси непосредственно перед использованием несколько раз ополоснуть дистиллированной водой. Для отбора необходимых объемов субстратного буфера и раствора ТМБ использовать только новые наконечники.
6.11. Внести во все лунки по 0,1 мл субстратной смеси и инкубировать стрипы в темноте в течение 15-20 мин в зависимости от степени развития окраски.
6.12. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и субстратную смесь, по 0,05 мл “Стоп-реагента" для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере 5мин.
6.13. Измерить оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм. Рассчитать для каждой калибровочной или исследуемой пробы величину В -В0, где В - среднее значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочные или исследуемые пробы, В0 - среднее значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочную пробу “0 пг\мл”
6.14. В линейных координатах на масштабной бумаге построить для калибровочных проб график зависимости оптической плотности в единицах оптической плотности (ОП) от концентрации IL-17А в пг\мл. Определить содержание IL-17А в пробах по калибровочному графику. Характерный вид графика представлен на рис.1

7. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

7.1. Коэффициент вариации результатов 10 определений IL-17А в одном и том же образце с использованием набора не превышает 10%.
7.2. Чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация IL-17А в исследуемых образцах не превышает 50 пг\мл.
13EMBED MSGraph.Chart.8 \s1415

8.УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ НАБОРА

8.1. Набор “ИФА-IL-17А” должен хранится при температуре 2...60С.
В случае дробного применения компоненты набора необходимо хранить следующим образом;
концентрат антител и коньюгата после вскрытия хранить не более одного месяца при температуре +2...60C;
растворенные калибровочные пробы хранить не более одного месяца при температуре минус 20оС;
стрипы в герметичной упаковке из фольгированного полиэтилена хранить при температуре +2...60С в течении всего срока годности;
“ТМБ”, “Буфер С” хранить в темноте при +2...60С в течение всего срока годности;
“Буфер А” при температуре +2...60С в течении всего срока годности;
однократный промывочный буфер хранить в закрытом сосуде при +2...60С в течение одного месяца.
8.2. При вскрытии и растворении лиофилизованных компонентов необходимо следить, чтобы на пробках не оставалось сухого вещества.
8.3. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции и квалифицированное проведение анализа.


ooo "Цитокин", 197110, г. Санкт-Петербург, ул. Пудожская дом 7, тел: (812)230-78-62, тел: (812)230-48-88, факс: (812)230-49-46. [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]

Root Entry

Приложенные файлы

  • doc 15053198
    Размер файла: 96 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий